|
| 產(chǎn)地 | 中國 |
| 品牌 | Solarbio |
| 貨號 | D1130 |
| 用途 | |
| 包裝規(guī)格 | 10T |
| CAS編號 | |
| 純度 | 現(xiàn)詢客服% |
| 是否進(jìn)口 |
規(guī)格：10T ?
保存：RNA酶，溶菌酶于-20?℃保存，其它試劑室溫保存。復(fù)檢期一年。
產(chǎn)品內(nèi)容：
| 試劑盒組成 | D1130-10T |
| RNase A | 1ml |
| 溶菌酶 | 10ml |
| 溶液Ⅰ | 60ml |
| 溶液Ⅱ | 60ml |
| 溶液Ⅲ | 80ml |
| 漂洗液 | 15ml×2 |
| 洗脫液 | 30ml |
| 吸附柱 | 10個 |
| 收集管 | 20個 |
| 說明書 | 1份 |
注意：使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶體上的標(biāo)簽。溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA（將試劑盒中提供的?RNaseA?全部加入），混勻，置于?2-8℃保存。如非指明，所有離心步驟均為使用臺式離心機(jī)在室溫下離心。
操作步驟：?
1、取50-200ml?細(xì)菌培養(yǎng)物，11000rpm離心5min，盡量吸除上清（菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）。
2、向留有菌體沉淀的離心管中加入5ml?溶液Ⅰ和1ml?溶菌酶，混勻。37℃水浴30 min?以上（根據(jù)菌液量可適當(dāng)加長水浴時間，請先檢查溶液Ⅰ是否已加入?RNaseA），使用移液器或旋渦振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀。注意：如果菌塊未徹底混勻，會影響裂解導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低。
3、向離心管中加入?5ml?溶液Ⅱ，溫和地上下翻轉(zhuǎn)?6-8?次使菌體充分裂解。注意：混勻一定要溫和以免污染基因組DNA，此時菌液應(yīng)變得清亮粘稠，作用時間不要超過5 min，以免質(zhì)粒受到破壞。
4、向離心管中加入?7ml?溶液Ⅲ，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)?6-8?次，充分混勻，此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。11000rpm離心10 min?，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到另一個干凈的離心管中，盡量不要吸出沉淀。注意：溶液Ⅲ加入后應(yīng)立即混勻，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。
5、將上一步所得上清液加入吸附柱中（吸附柱加入收集管中），室溫放置2min，11000rpm?離心2min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中(?如果一次加不完，可分兩次吸附)?。
6、向吸附柱中加入7ml?漂洗液（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），11000rpm離心2min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
7、向吸附柱中加入7ml?漂洗液，11000rpm離心2min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
8、11000rpm離心5min，將吸附柱敞口置于室溫或?50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)如酶切、PCR?等。
9、將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加?1-2ml?經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置5min，11000rpm離心2min，收集質(zhì)粒DNA溶液。
10、（可選）為了增加質(zhì)粒的回收率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置5min，11000rpm離心2min。
注意事項(xiàng)：?
1、使用前請先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象，可在?37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復(fù)澄清后再使用。
2、洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于500ul，體積過小影響回收效率；洗脫液的pH?值對洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其?pH值在8.0左右(?可用NaOH?將水的pH值調(diào)至此范圍)?，pH值低于7.0會降低洗脫效率。DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解。
3、如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?；虼笥?10kb的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量，使用400-800ml過夜培養(yǎng)物，同時按照比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量，吸附和洗脫時可以適當(dāng)?shù)难娱L時間，以增加提取效率。
4、DNA濃度及純度檢測：得到的質(zhì)粒DNA純度與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關(guān)。得到的DNA可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測濃度與純度。DNA應(yīng)在OD260處有顯著吸收峰，?OD260?值為1?相當(dāng)于大約50 μg/ml雙鏈DNA、40 μg/ml?單鏈DNA。OD260/OD280比值應(yīng)為1.7-1.9?，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會偏低，因?yàn)閜H值和離子存在會影響光吸收值，但并不表示純度低。
相關(guān)文獻(xiàn)：
《A modified method for plasmid extraction from Lactobacillus plantarum contained lysozyme removal step》 作者:F.Yao,X.Y.Xu,Q.Pan 期刊:Analytical Biochemistry 影響因子:2.507 PMID:30408458
